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基因擴增PCR的擴增與克隆方法及一些使用的小建議

更新時間:2020-11-24點擊次數:2466

 基因擴增PCR主要有冰箱、超凈臺、加樣器、混勻器、天平等。加樣器、天平除了要外,還應有定期校準。試劑分裝應在超凈臺中進行,擴增反應混合液應使用分子生物學級的,試劑制備好后應有質檢:一是否有污染、二是檢測試劑的擴增效果。

 

  基因擴增PCR的擴增與克隆方法:

  ①引物的序列應位于基因組DNA的高度保守區,且與非擴增區無同源序列。這樣可以減少引物與基因組的非特異性結合,提高反應的特異性

 

  ②引物長度:15-40bp為宜。引物過短或過長均可使反應的特異性下降。

 

  ③引物的堿基盡可能隨機發布,避免出現數個嘌呤或嘧啶的連續排列,G+C堿基的含量在40%-75%之間。

 

  ④引物內部應避免形成二級結構,特別是引物的末端應避免有回文結構。

 

  ⑤二個引物不應有互補序列,特別是3’端應避免互補,以免形成“引物二聚體”,浪費引物。

 

  ⑥引物5’末端堿基無嚴格限制,在與模板DNA結合的引物長度足夠的條件下,其5’端堿基可不與模板DNA互補而呈游離狀態,因此可在引物5’端加上限制性內切酶位點、啟動子序列或其它序列等以便于PCR產物的分析克隆等,引物的5’端至多可加10個堿基而對PCR反應無影響。

  基因擴增PCR的使用建議:

  1、使用本制品時務必將Buffer反復混勻后再加,避免因組分不一導致結果差異;

 

  2、配置和分裝反應液時請一定使用新的(無污染的)噴頭以避免污染;

 

  3、如擴增條帶多,可適當添加酶和dNTPs;

 

  4、當多重PCR擴增產物的長度均在1kb以內時,使用3%~4%濃度的Agarosegel進行電泳分離效果。

 

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